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實時熒光定量PCR儀操作流程

點擊次數:759 更新時間:2025-02-11
  實時熒光定量PCR儀的基本原理是利用DNA聚合酶在PCR過程中合成新DNA鏈的特性,結合一種熒光標記的探針或染料,通過實時監測熒光信號的增加來測量PCR反應的進行程度。在PCR反應體系中加入熒光基因,利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程。隨著反應時間的進行,監測到的熒光信號的變化可以繪制成一條曲線。
 
  由于在PCR擴增的指數時期,模板的Ct值(即樣品到達域值水平所經歷的循環數)和該模板的起始拷貝數存在線性關系,所以可以作為定量的依據。域值應設定在使指數期的擴增效率為最大,這樣可以獲得最準確、可重復性的數據。如果同時擴增的還有標有相應濃度的標準品,線性回歸分析將產生一條標準曲線,可以用來計算未知樣品的濃度。
 
  使用實時熒光定量PCR儀的一般操作流程包括:
 
  設計引物和探針:根據實驗目的,選擇合適的基因序列,設計特異性引物和熒光探針。
 
  準備樣本:提取待檢測的核酸樣本,如DNA或RNA,并確保樣本的質量和純度。
 
  準備反應體系:將所需的試劑和樣本加入PCR反應管中,組成反應體系。包括引物、探針、酶、緩沖液、dNTPs和核酸模板等。
 
  設置儀器參數:打開儀器,選擇合適的PCR程序,并根據實驗要求設置溫度、時間、循環次數等參數。同時,設置熒光檢測通道和參數。
 
  放置樣本:將準備好的PCR反應管放入儀器的樣品槽中,確保放置正確且穩固。
 
  啟動程序:確認設置無誤后,啟動PCR程序。儀器將按照設定參數進行溫度循環和熒光檢測。
 
  實時監測與分析:通過儀器顯示屏實時監測熒光信號變化,觀察擴增曲線形狀和趨勢。實驗結束后,儀器自動生成結果,包括擴增曲線、Ct值等。使用軟件對結果進行分析和處理。

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